انتقال ژنهای pvpgip1 و pvpgip2 به گیاه چغندرقند بصورت منفرد وتوأم

چکیده محصولات کشاورزی نقش مهمی در تأمین غذای جهان ایفا می کنند، رشد جمعیت دنیا و کمبود مواد غذایی باعث شده است که محققین در جستجوی روش‏های موثر برای افزایش مواد غذایی باشند. استرس های زیستی و غیرزیستی از عوامل مهم در کاهش عملکرد و تولید محصولات کشاورزی می باشند. در این میان در طول کشت گیاهان زراعی کاهش محصول ناشی از حمله قارچهای پاتوژن به گیاهان همواره به عنوان اصلی‏ترین عامل زیانهای اقتصادی محسوب می شود. چغندر قند از مهمترین گیاهان صنعتی بوده و بازده محصول تحت تاثیر بسیاری از پاتونهای قارچی به نسبت زیادی کاهش می یابد. آنزیمهای پلی گالاکتوروناز (pg) مهمترین فاکتور بیماریزای قارچهای پاتوژن هستند. بسیاری از قارچهای پاتوژن برای تخریب ترکیبات هموگالاکتورونان دیواره سلول گیاهی نیاز به تولید آنزیم pg دارند. یکی از مهمترین ژن های دفاعی گیاهان در مقابل حملات پاتوژن های قارچی از دسته ژنهای مهاری آنزیم های پکتینازی به نام پروتئین مهار کننده آنزیم پلی گالاکتوروناز(pgip) می باشند. آنزیم های پلی گالاکتوروناز pg)) توسط اغلب قارچ های فیتوپاتوژن تولید می شوند و فرمهای ایزوآنزیمی مختلفی را نشان می دهند. pgipها به علت پتانسیل برهمکنش با pgهای قارچی مهمترین فاکتور سیستم دفاعی گیاه بر علیه قارچ های پاتوژن هستند. در نتیجه این بر همکنش تجزیه پکتین دیواره سلول گیاهی کاهش می یابد و ogهای تولید شده باعت القائ سیستم دفاعی گیاه می گردند. بنابراین با بیان pgip در گیاهان تراریخت، فاکتور بیماریزای پاتوژن قارچی (pg) غیر فعال شده و رشد و توسعه آن کاهش می یابد. در این راستا ژنهای pvpgip1 و pvpgip2 که از گیاه لوبیا واریته ناز استخراج و بترتیب در وکتورهای بیانی گیاهی pbiah17 وpbiah23 کلون شده بود، در این تحقیق ضمن ساخت ژن کایمریک sp-pgip2-aaa-pgip1، این ژنها از طریق باکتریa. tumefaciens gv3101 به دو ژنوتیپ sbsi-01 و sbsi-02 گیاه چغندر قند (بصورت منفرد و توام) منتقل گردیدند. سازه واجد ژن کایمری pgip1 sp-pgip2–aaa- حاوی ژنهای pgip1 و pgip2 که بوسیله لینکر 3 اسید آمینه ای آلانین به هم متصل شده اند جهت انتقال به گیاه طراحی و ساخته شد. آنالیز های بیوانفورماتیکی نشان داد که بطور همزمان هر دو نوع پروتئین خاصیت مهاری خود را اعمال خواهند کرد. ارزیابی ساختار ثانویه mrna کایمری pgip2-aaa-pgip2 نشان داد که این ساختار، انرژی قابل قبولی برای یک mrna به منظور ترجمه در سیستم گیاهی می باشد. قبل از انتقال به چغندر قند به منظور اطمینان از ساختار سازه pbirmpp جهت بیان پروتئین کایمر sp-pgip2-aaa-pgip1 با استفاده از روش agroinfitration بصورت بیان موقت (transient) در برگ گیاه توتون بیان گردید. نتایج حاصل از انجام وسترن بلات پروتئین نشان داد که سازه pbirmpp در گیاه توتون بیان شده و پروتئین مورد انتظار در محدوده 70 کیلو دالتون قابل شناسایی می باشد. از برگ حاصل از کشت بافت جوانه رأسی جهت تراریختی استفاده شد. جهت تراریختی از دو روش پایه جوانه و ایجاد خراش با تیغ در ناحیه رگبرگ اصلی جداکشت های برگی استفاده گردید. از ژن مقاومت به کانامایسین برای انتخاب گیاهان تراریخت استفاده شد. به منظور تائید انتقال ژنهای pgip1 و pgip2 بصورت منفرد و توام به دو رقم sbsi-01 وsbsi-02 گیاه چغندر قند، از آزمون pcr و ساترن بلات استفاده گردید. با استفاده از آنالیز pcr حضور ژنpvpgip1 در 20 و 19 تا از گیاهان سبز مقاوم به کانامایسین بترتیب 4 در صد و 8/3 در صد، حضور ژنpvpgip2 در 22، 21 تا از گیاهان سبز مقاوم به کانامایسین بترتیب 4/4 در صد و 2/4 در صد، حضور ژن کایمر sp-pgip2-aaa-pgip1 در 17 و 15 تا از گیاهان سبز مقاوم به کانامایسین بترتیب 5 در صد و 5/5 در صد بترتیب در رقم های sbsi-01 و sbsi-02 تأیید گردید. جهت سنجش فعالیت مهارکنندگی پروتئین های pgip در گیاهان چغندرقند تراریخت از پلی گالاکتوروناز (pg) قارچ colletotrichum lindemuthianum برای غربال گری گیاهان تراریخت حاوی pgip1، از pg قارچ f. phyllophilum جهت غربال گری گیاهان تراریخت حاوی pgip2 و از pg قارچ f. oxysporum. f. sp. betae (fob) جهت غربال گری گیاهان تراریخت حاوی پروتئین کایمر استفاده گردید، فعالیت مهارکنندگی pgip بر علیه آنزیمهای پلی گالاکنوروناز توسط روش assay agarose diffusion سنجش گردید. پروتئین استخراج شده از گیاه غیر تراریخت (control) هیچ گونه فعالیت مهاری بر علیه fg های مورد استفاده نشان نداد. سایر گیاهان تراریخت فعالیت های مهاری متفاوتی نشان دادند. حضور ژنهای pvpgip1 و pvpgip2 با استفاده از آزمون ساترن بلات در این گیاهان مورد تائید قرار گرفت. گیاهان تراریخت pvpgip1 حاوی 2 کپی از ژن و یک گیاه حاوی 3 کپی و بقیه تک کپی بودند. و از گیاهان تراریخت pvpgip2 دو تا حاوی 2 کپی از ژن و بقیه تک کپی بودند. هیج گونه تغییراتی در فنوتیپ و نیز در رشد و نمو گیاهان تراریخت مشاهده نشد. در مطالعه دیگر ژنهای pgip1، pgip2 و ژن کایمر pgip2-aaa-pgip2 جهت مطالعات پروئینی در سیستم مخمر p. pastoris با استفاده از وکتور بیانی pgapz?a بیان گردید. بعد از تایید پلاسمید های نوترکیب pgapz?apgip1، pgapz?apgip2 و pgaprmpp با تعیین توالی، این سازه های بیانی به سلولهای مخمر p. pastoris جهت بیان منتقل شدند. پروتئین های pgip2 و موتانت های آن pgip2t37d و pgip2t177d که با استفاده از site-direction mutation تهیه شدند و پروتئین کایمر pgip2-aaa-pgip1 در سیستم p. pastoris با موفقیت بیان گردیدند. پروتئین pgip1 به دلایل نا مشخص در این سیستم بیان نشد. بیان و فعالیت پروتئین ها با استفاده از وسترن بلات و روش سنجش فعالیت مهارکنندگی agarose diffusion assay مورد بررسی و تائید قرار گرفت. تغییر اسیدآمینه t37 به d37 در موتانت pgip2t37d تاثیری در فعالیت پروتئین pgip2 نداشت ولی تغییر اسیدآمینه t177 به d177 در موتانتpgip2t177d باعث غیر فعال شدن pgip2 گردید. بنابراین می توان نتیجه گرفت که اسید آمینه t177 در ناحیه گلیکوزیلاسیون که در جایگاه فعال pgip2 قرار دارد قرار گرفته و در فعالیت پروتئین نقش کلیدی دارد.